高壓滅菌器在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌其高度耐熱的芽孢。在壓力降到0.5MPa，可緩慢放出蒸氣，應注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當壓力降到零后，才能開蓋，取出培養基，擺在平臺上，以待冷凝。不可久不放氣，引起培養基成分變化，以至培養基無法擺斜面 。一旦放置過久，由于鍋爐內有負壓，蓋子打不開，只要將放氣閥打開，大氣壓入，內外壓力平衡，蓋子便易打開了。
高壓滅菌器待滅菌的物品放置不宜過緊，必須將冷空氣充分排除，否則鍋內溫度達不到規定溫度，影響滅菌效果，滅菌完畢后，不可放氣減壓，否則瓶內液體會劇烈沸騰，沖掉瓶塞而外溢甚至導致容器爆裂。須待滅菌器內壓力降至與大氣壓相等后才可開蓋。
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